3-2-1- تهیهی محلولهای کازئینی، کازئینبتا و تعیین غلظت آنها28
3-2-2- تهیهی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با
استفاده از کازئینبتا28
3-2-3- تهیهی محلولهای مورد نیاز برای الکتروفورز ژلی30
3-2-3-1-تهیه محلول SDS 20 درصد30
3-2-3-2- تهیه محلول آمونیوم پر سولفات (APS)30
3-2-3-3- تهیه محلول آکریلامید و بیس آکریلامید31
3-2-3-4- تهیه بافر تریس 5/1 مولار31
3-2-3-5- تهیه بافر تریس 5/0 مولار31
3-2-3-6- تهیه بافر تانک به حجم 500 میلیلیتر31
3-2-3-7- تهیه بافر نمونه X232
3-2-3-8- تهیه 100 میلیلیتر محلول کوماسیبلو33
3-2-3-9- تهیه محلول رنگ بر ژل33
3-2-4- تهیه محلول OPA به حجم 50 میلیلیتر33
3-2-5- تهیه محلول فلورسامین34
عنوان صفحه
3-2-6- تهیه محلول ANS35
3-2-7- تهیه محلول ABTS رادیکال36
3-2-8- تهیه عصارهی ACE از پودر استون شش خرگوش37
3-3-روشها38
3-3-1- تخلیص کازئینبتا شیرگاو38
3-3-2- تخلیص هموگلوبین A از خون انسان39
3-3-3- تعیین میزان خلوص پروتئین با استفاده از SDS-PAGE40
3-3-4- تهیه پودر استون شش خرگوش40
3-3-5- قندی کردن کازئینبتا و کازئینهای شیرگاو به روش غیرآنزیمی41
3-3-6- آزمونهای OPA و فلورسامین برای تایید فرآیند
قندی شدن غیرآنزیمی41
3-3-7- مطالعهی فلورسانس ذاتی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی42
3-3-8- مطالعهی فلورسانس عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی43
3-3-9- مطالعه تغییرات ساختاری کازئینهای بتای قندی و غیرقندی،
با استفاده از دستگاه دورنگ نمایی دورانی43
3-3-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی44
3-3-11- هضم کازئینهای شیرگاو و کازئینبتای قندی و غیرقندی
به وسیلهی آنزیمهای تریپسین و کیموتریپسین پانکراس گاوی44
3-3-12- مطالعهی فعالیت آنتیاکسیدانی کازئینهای شیرگاو کازئینبتای
قندی و غیرقندی45
3-3-13- مطالعهی فعالیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینبتا
قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها47
3-3-14- مطالعهی توان آلرژیزایی کازئینها و کازئینبتای قندی
و غیرقندی47
عنوان صفحه
3-3-15- آزمون آماری48
فصل چهارم: نتایج و بحث
4-1- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیتهای زیستی
(چاپرونی، آنتیاکسیدانی و مهار آنزیمACE ) و آلرژیزایی کازئینبتا50
4-1-1- تخلیص پروتئین کازئینبتا50
4-1-2- تخلیص هموگلوبینA از خون انسان51
4-1-3- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا
در حضور مادهی احیا کننده52
4-1-3-1- مطالعهی قندی شدن کازئینبتا با استفاده از ترکیب OPA53
4-1-3-2- مطالعه فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده
از ترکیب فلورسامین54
4-1-3-3- استفاده از ژل SDS-PAGE احیایی برای تایید فرآیند
قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا55
4-1-4- مطالعهی فلورسانس ذاتی و عارضی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی56
4-1-5- مطالعه ساختار دوم کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با استفاده
از دستگاه دورنگ نمایی دورانی58
4-1-6- مطالعه فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی60
4-1-7- هضم آنزیمی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی با آنزیمهای
تریپسین و کیموتریپسین62
4-1-7-1- تایید فرآیند هضم آنزیمی با استفاده از ژلSDS-PAGE
(15درصد) احیایی63

عنوان صفحه
4-1-7-2- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای بتای قندی
و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنها65
4-1-7-3- مطالعه خاصیت مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای
بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها71
4-1-8- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای
حاصل از هضم آنزیمی آنها73
4-2- مطالعه اثر قندی شدن غیرآنزیمی بر ساختار، فعالیت آنتیاکسیدانی
و آلرژیزایی کازئینهای شیرگاو77
4-2-1- جداسازی و قندی کردن کازئین شیرگاو77
4-2-2- تایید فرآیند قندی شدن کازئینهای شیرگاو77
4-2-2-1- استفاده از ژل SDS-PAGE (12 درصد) برای تایید
قندی شدن غیرآنزیمی77
4-2-2-2- استفاده از ترکیب OPA برای مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی
کازئینهای شیرگاو78
4-2-3- هضم آنزیمی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو با آنزیمهای
تریپسین و کیموتریپسین80
4-2-4- مطالعه فعالیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم آنها82
4-2-5- مطالعه آلرژیزایی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو و پپتیدهای
حاصل از هضم آنزیمی آنها به وسیلهی دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین86
عنوان صفحه
خلاصهی نتایج 90
نتیجهگیری نهایی91
فهرست منابع و مآخذ92
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر در جانوران مختلف بر حسب درصد4
جدول1-2- برخی ویژگیهای پروتئینهای آب پنیر شیرگاو6
جدول1-3- برخی از ویژگیهای کازئینهای شیرگاو7
جدول3-1- رسم منحنی استاندار برادفورد با استفاده از کازئینبتا
(1 میلی گرم بر میلی لیتر) به عنوان پروتئین استاندارد29
جدول 3-2- مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه 500 میلی لیتر بافر تانک32
جدول3-3- مواد و مقادیر مورد نیاز برای تهیه 25 میلی لیتر بافر نمونه X232
جدول4-1-1- محتوی ساختارهای دوم نمونههای کازئینبتای قندی و غیرقندی
بر حسب درصد59
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل1-1-نمایی از ترکیبات موجود در شیر3
شکل1-2- پروتئینهای تشکیل دهنده شیرگاو5
شکل1-3- نمایی از چگونهگی تشکیل میسل کازئین شیر8
شکل 1-4- جهش جایگزینی پرولین67 وتبدیل آن به هیستیدین در کازئینبتا A19
شکل1-5- نمایی از سیستم رنین- آنژیوتنسین به عنوان سیستم
مهم تنظیم کننده فشار خون13
شکل1-6-نمایی از انواع اپیتوپهای خطی و فضایی پروتئینی17
شکل1-7- علائم حساسیت به شیرگاو17
شکل1-8- آزمون خراش پوستی برای تعیین میزان حساسیت فرد به مادهی آلرژیزا19
شکل 3-1- نمونهایی از نمودار استاندار برادفورد30
شکل 3-2- نمایی از ساختارشیمیایی ترکیب OPA34
شکل 3-3- نمایی ازساختار شیمیایی فلورسامین35
شکل 3-4- نمایی از ساختار شیمیایی ترکیب ANS36
شکل 3-5- تولید ABTS رادیکال در حضور پتاسیم پرسولفات37
شکل 3-6- نمونهایی از نمودار استاندارد ترولوکس46
شکل4-1-1- نمایی از SDS-PAGE احیایی (12درصد) مراحل خالصسازی پروتئین
کازئینبتا51
عنوان صفحه
شکل4-1-2- نمایی از SDS-PAGE احیایی (12درصد) فرآیند خالصسازی
پروتئین هموگلوبین A انسانی52
شکل4-1-3- نتایج مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین کازئینبتا
با استفاده از آزمون OPA53
شکل4-1-4- نتایج حاصل از قندی شدن غیرآنزیمی کازئینبتا با استفاده
از آزمون فلورسامین54
شکل4-1-5- نمای از SDS-PAGE احیایی (12درصد) که به منظور تایید
قندی شدن پروتئین در این مطالعه استفاده شد55
شکل 4-1-6- طیف نشری فلورسانس ذاتی کازئینبتای قندی و غیرقندی56
شکل4-1-7- نمایی از نشر فلورسانس عارضی کازئینهای بتا ی قندی و غیرقندی
که با استفاده از نشانگر فلورسانس ANS بررسی شد57
شکل4-1-8- طیف دور فرابنفش (Far-Uv CD) کازئینبتای قندی و غیرقندی59
شکل4-1-9- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی
با استفاده از هورمون انسولین به عنوان پروتئین هدف61
شکل4-1-10- مطالعهی فعالیت چاپرونی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی
با استفاده از هموگلوبین به عنوان پروتئین هدف62
شکل4-1-11- نمایی از SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای بتای
قندی و غیرقندی با آنزیم تریپسن63
شکل4-1-12- نمایی از SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای بتای
قندیو غیرقندی با آنزیم کیموتریپسن64
شکل4-1-13- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینبتای قندی و غیرقندی
و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم تریپسین66
عنوان صفحه
شکل4-1-14- این شکل بیانگر ظرفیت آنتیاکسیدانی معادل ترلوکس (TEAC)
کازئینبتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و 4 ساعتهی آنها
با آنزیم تریپسین میباشد67
شکل4-1-15- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینبتای قندی و غیرقندی
و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم کیموتریپسین69
شکل4-1-16- این شکل بیانگر ظرفیت آنتیاکسیدانی معادل ترلوکس (TEAC)
کازئینبتای قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و 4 ساعتهی آنها
با آنزیم کیموتریپسین میباشد70
شکل4-1-17- نتایج آزمون مهار آنزیم ACE به وسیلهی کازئینهای بتای
قندی و غیرقندی و پپتیدهای حاصل از هضم آنها به وسیلهی
دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین71
شکل4-1-18- نتایج بررسی میزان آلرژیزایی کازئینبتای قندی و غیرقندی
و پپتیدهای حاصل از هضم 4 ساعتهی آنها به وسیلهی دو آنزیم تریپسین
و کیموتریپسین74
شکل4-1-19- مقایسهی میزان آلرژیزایی کازئینهای بتای قندی و غیرقندی
با پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین75
شکل4-2-1- نمای از SDS-PAGE احیایی (12درصد) که به منظور تایید
قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین در این مطالعه استفاده شد78
شکل4-2-2- نتایج مطالعهی قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین کازئینبتا با استفاده
از آزمون OPA79
شکل4-2-3- ژل SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای قندی
و غیرقندی شیرگاو به وسیلهی آنزیم تریپسین80
عنوان صفحه
شکل4-2-4- نمایی از SDS-PAGE احیایی (15درصد) هضم کازئینهای قندی
و غیرقندی شیرگاو با آنزیم کیموتریپسن81
شکل4-2-5- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم تریپسین82
شکل4-2-6- مطالعه خاصیت آنتیاکسیدان کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم این پروتئین به وسیلهی آنزیم کیموتریپسین83
شکل 4-2-7- در این شکل معادل ترولوکس (TEAC) کازئین قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و4 ساعته با آنزیم تریپسین آمده است84
شکل 4-2-8- در این شکل معادل ترولوکس (TEAC) کازئینهای قندی و غیرقندی
شیرگاو و پپتیدهای حاصل از هضم 2 و4 ساعته با آنزیم کیموتریپسین آمده است85
شکل4-2-9- نتایج آزمون سنجش آلرژی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
و پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها87
شکل4-2-10- مقایسهی میزان آلرژیزایی کازئینهای قندی و غیرقندی شیرگاو
با پپتیدهای حاصل از هضم آنزیمی آنها با دو آنزیم تریپسین و کیموتریپسین88
جدول اختصارات
نام کاملنام اختصاریAngiotensin Converting EnzymeACE2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)ABTS8- aniline-1-naphthalenesulfonic acidANSAmmunium persulfateAPSBovine serum albuminBSACircular dichroismCDEthylenediaminetetraacetic acidEDTAN-3-2-furylacrylolyl-phenylalanylglycylglycinFAPGGIntrinsically unstructured proteinIUPO- phthaladehydeOPATrolox Equivalent Antioxidant CapacityTEAC

فصل اول

مقدمه
1-1- شیر
شیر یک مایع زیستی پیچیده متشکل از آب، پروتئین، چربی، کربوهیدرات، مواد معدنی و برخی ترکیبات فعال زیستی از جمله آنزیمها و ویتامینها میباشد که به عنوان اولین ماده غذایی برای نوزاد، بوسیله غدد پستانی موجودات پستاندار ساخته میشود. در اوایل دوران شیردهی، شیر آغوز1 نامیده میشود که سرشار از آنتیبادیهایی است که خطر ابتلای نوزاد به بسیاری از بیماریها را کاهش میدهد. شیر به عنوان اولین مادهی غذایی برای نوزاد شامل اکثر ترکیبات ضروری و مورد نیاز برای رشد و نمو است. در شکل (1-1) ترکیبات اصلی موجود در شیر مشاهده میشود (Pehrsson، 2000).
شکل1-1- نمایی از ترکیبات موجود در شیر.
شیر نه تنها به عنوان یک مادهی غذای برای تغذیهی نوزاد تازه متولد شده مطرح است بلکه به عنوان یک مادهی غذایی ارزشمند و مغذی برای انسان در تمام کشورهای جهان استفاده می شود. امروزه در سراسر جهان دامداریهای بزرگ در سطح وسیع به تولید شیر و محصولات لبنی مشغولند به طوریکه در سال 2011 میزان تولید شیر در جهان 730 میلیون تن بوده است. هندوستان به عنوان بزرگترین کشور تولید و مصرف کننده شیر در جهان و نیوزلند، 28کشور عضو اتحادیه اروپا، استرالیا و ایالات متحدهی آمریکا به عنوان بزرگترین صادر کننده های شیر و محصولات لبنی میباشند. همچنین چین و روسیه به عنوان بزرگترین واردکنندگان شیر و محصولات لبنی در جهان شناخته میشوند (Blasko، 2011).

1-2- ترکیبات شیر
همانطور که در بالا ذکر شد، شیر یک مادهی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات، چربی و ترکیبات معدنی است. درصد، اندازه و نوع هر یک از ترکیبات تشکیل دهنده شیر بسته به گونه جاندار متفاوت است. به عنوان مثال درصد پروتئین شیر انسان نسبت به شیر گاو پایینتراست در صورتی که درصد کربوهیدرات و چربی آن بالاتر میباشد. شیر اسب و الاغ کمترین میزان چربی را در بین گونههای مختلف دارد. همچنین شیر انسان فاقد پروتئین بتالاکتوگلوبولین2 است، درصورتی که این پروتئین یکی از پروتئینهای اصلی آب پنیر است و به مقدار قابل ملاحظهایی در شیرگاو دیده میشود. در جدول (1-1) درصد ترکیبات موجود در شیر برخی جانوران مشاهده میشود (Nelson و همکاران 1951 ، Barlowska و همکاران 2011).
جدول1-1- ترکیبات سازنده شیر جانوران مختلف بر حسب درصد.
1-3- پروتئینهای شیر
اکثر پروتئینهای شیر در طول زمان شیردهی بوسیلهی سلولهای پوششی غدد پستانی تولید و ترشح میشود. این سلولها علاوه بر پروتئین، ترکیبات دیگری مانند چربی (تریآسیل گلیسرول3 و دیگلیسرول4) و کربوهیدرات (لاکتوز5) را نیز تولید و ترشح میکنند (Bouguyo و همکاران 2006، De Kruif و همکاران 2003).
پروتئینهای شیر از نظر ارزش غذایی و فعالیت زیستی بسیار حائز اهمیت هستند و به دو گروه کازئینها (آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین) و پروتئینهای آبپنیر (آلفالاکتالبومین6، بتا لاکتوگلوبولین، سرم آلبومین7 و ایمونوگلوبولین8) تقسیم میشوند. کازئینهای شیر گاو 80 درصد و پروتئینهای آبپنیر بین20 تا 45درصد کل پروتئینهای شیر انسان را تشکیل
میدهند ( Kunz و همکاران 1990، Wong و همکاران 1996).
شکل1-2- پروتئینهای تشکیل دهنده شیرگاو.
1-3-1- پروتئینهای آبپنیر
پروتئینهای آبپنیر از نوع کروی هستند که حدود 20 درصد پروتئینهای شیر را شامل می شوند. از لحاظ ساختاری این پروتئینها دارای مقدار قابل توجهی مارپیچآلفا9 در ساختارشان میباشند.
آمینواسیدهای اسیدی، بازی، آبگریز10 و آبدوست11 به صورت نسبتا متعادل در طول زنجیره ی پلیپپتیدی این پروتئینها وجود دارد. این پروتئینها در محیط آبی شیر به صورت محلول هستند (Evans، 1982).
پروتئینهای آبپنیر شامل بتالاکتوگلوبولین، آلفالاکتالبومین، ایمونوگلوبولین، آلبومین سرمی، لاکتوفرین12 و لاکتوپراکسیداز13 میباشد که غلظت و درصد این پروتئینها در شیر نسبت مستقیم با نوع آبپنیر شامل اسیدی با pH پایین تر از 1/5 و بازی با pH بالاتر یا مساوی 6/5، منبع شیر ( گونهی حیوان)، زمان سال، نوع خوراک حیوان و مرحلهی شیردهی دارد (Pintado 2001).
فعالیتهای زیستی مختلفی به پروتئینهای آبپنیر نسبت داده شده است که از بین این فعالیتها، خواص ضد میکروبی این پروتئینها به میزان زیادی بررسی شده است (Clare وهمکاران 2003).
جدول1-2- برخی ویژگیهای پروتئینهای آبپنیر شیرگاو.
1-3-2- کازئینها
کازئینها فسفو پروتئینهایی غنی از آمینواسیدهای گلوتامین، لوسین، سرین، لیزین و پرولین میباشند که80 درصد پروتئینهای شیرگاو را تشکیل میدهند. کازئینها به چهار گروه اصلی آلفا S1، آلفا S2، بتا و کاپا کازئین تقسیم میشوند. این پروتئینها تحت تاثیر تغییرات پس از ترجمه نظیر فسفوریلاسیون و گلیکوزیلاسیون قرار میگیرند و به صورت امولسیون یا معلق در فاز آبی شیر وجود دارند. این پروتئینها ساختارهای کروی به نام میسل کازئینی تشکیل می دهند (Wong 1996، Dalgleish و همکاران 1998). در جدول زیر برخی ویژگیهای کازئین ها مشاهده میشود.
جدول1-3- برخی از ویژگیهای کازئینهای شیرگاو.
میسل کازئین دارای اندازههای متنوعی از 20 تا300 نانومتراست. تشکیل میسل در شیر رابطهی مستقیم با غلظت کازئین، دما، pH و مقدار یونهای موجود در شیر از جمله کلسیم دارد (Dekruif و همکاران2003، Leclerc و همکاران 1997).
همچنین مطالعات گذشته نشان داده است که یون کلسیم فرایند تشکیل میسل را تسهیل میکند. یون کلسیم از طریق اتصال به گروهای فسفر باقیماندههای آمینواسیدهای سرین فسفوریله در بخشهای آبدوست پروتئین باعث تشکیل پلهای کلسیم- فسفات بین کازئینها میشود که این پدیده به نوبهی خود به فرآیند تشکیل میسل کمک میکند (Rollema و همکاران 1992).

نیروهای اصلی پایدار کنندهی میسل، پیوندهای هیدروژنی، برهمکنشهای آبگریز و الکتروستاتیک، پیوندهای دیسولفید و پلهای نمکی (کلسیم، فسفر، منیزیم وسیترات) می باشد.
شکل1-3- نمایی از چگونگی تشکیل میسل کازئین شیر( Martin، 1999).
در بخشهای داخلی میسل کازئینی اغلب کازئینهای آلفا و بتا و در بخشهای سطحی آن کازئین کاپا دیده میشود. کازئینکاپا یک گلایکوپروتئین با بخش قندی متصل به انتهای C پروتئین است. مطالعات پیشین همچنین نشان داده است که وجود کازئین کاپا و گروههای کربوهیدرات آن در سطح میسل به پایداری و تعلیق میسل در فاز آبی کمک میکند به طوری که حذف انتهای C و گروه های کربوهیدراتی به وسیلهی آنزیمهایی مانند رنین باعث تخریب ساختار میسل میشود (Holt وهمکاران 1996و1992، Mc Mahon و همکاران 1998).
1-3-3- کازئینبتا
کازئینبتا یک فسفو پروتئین با زنجیرهی پلیپپتیدی شامل 209 آمینواسید و وزن مولکولی kDa 24 میباشد. این پروتئین دارای یک انتهایN کوتاه و قطبی و یک انتهای C بلند بدون بار و آبگریز است که به آن خاصیت دوگانهدوست14 میدهد. کازئینبتا در انتهایN دارای 5 گروه فسفاتی متصل به باقیماندههای آمینواسیدی سرین میباشد که بیشترین بار پروتئین را به خود اختصاص میدهد (Rollema و همکاران 1992). این پروتئین30 تا 36 درصد کازئین های شیرگاو را شامل میشود. ساختار دوگانه دوست کازئینبتا نقش مهمی در فعالیتهای زیستی مختلف آن از جمله فعالیت چاپرونی و تشکیل میسل و ایجاد ویژگیهای امولسیونی شیر دارد (Horne و همکاران 2002).
کازئینبتا شیر گاو به طور طبیعی به دو صورت A1 و A2 دیده میشود. نوع اصلی کازئین بتا A2 است در حالیکهA1 از جهش جایگزینی پرولین 67 با هیستیدین ایجاد شده است (Farrel و همکاران2004، Kaminski و همکاران 2007،Keating و همکاران 2008).

شکل 1-4- جهش جایگزینی پرولین67 وتبدیل آن به هیستیدین در کازئین بتاA1.
مطالعات پیشین نشان داده است که بین مصرف کازئین بتاA1 و مرگ و میر ناشی از بیماریهای قلبی- عروقی، سختی شریانهای خون و دیابت نوع یک رابطهی معنیداری وجود دارد. همچنین بررسیها نشان داده که تغذیه با کازئینبتاA1 در مقایسه با نوع A2 با افزایش میزان کلسترول خون و تجمع چربی در عروق خونی ارتباط دارد (Mc Lachlan و همکاران 2001، Tailford و همکاران 2003، Beales و همکاران 2002، Elliot و همکاران 1988).
همانطور که ذکر شد، هضم ناقص کازئین بتا باعث تولید پپتیدی به نام بتا-کازومورفین157 میشود که در انتهای خود دارای توالی پپتیدی پرولین-گلایسین-پرولین-ایزولوسین میباشد. این توالی مشابه توالی پروتئین ناقل گلوکز (GLUT2) در سلولهای بتای پانکراس است. اتصال بتا-کازومرفین7 به GLUT2 در سلولهای پانکراس باعث حملهی آنتیبادی به سلولهای بتای پانکراس و تخریب این سلولها و ایجاد دیابت نوع1 میشود. از طرفی برخی محققان عقیده دارند شباهت ساختار فضایی اپیتوپ16 کازئینبتا به برخی از سلولهای پانکراس باعث حملهی آنتیبادیها به این سلولها و تخریب آنها و ایجاد دیابت نوع 1 میشود (Woodford، 2008).
پروتئینهای کازئینی به دلیل دارا بودن درصد بالایی از آمینواسیدهای گلوتامین و پرولین (15 درصد) نمیتوانند ساختار دوم پایداری تشکیل دهند. از اینرو این پروتئینها متعلق به خانواده پروتئینی هستند که به اختصارIUP17 خوانده میشوند و به طور طبیعی فاقد ساختار دوم منظم میباشند (Farrell و همکاران 2006و2002، Holt و همکاران 1988، Tompa و همکاران 2002). مطالعه به کمک دستگاه دورنگنمای دورانی نشان داده است که در ساختار دوم کازئینبتا10درصد مارپیچآلفا و13درصد صفحات بتا وجود دارد. همچنین توالیهای پپتیدی 28 تا 1و 52 تا 31 در محیط آبی ساختار پیچه نامنظم18 دارند (Rollema وهمکاران1992، Holt وهمکاران 1993).
1-4- فعالیتهای زیستی کازئینها
1-4-1- فعالیت چاپرون کازئینهای شیر
چاپرونها دستهای از مولکولهای پروتئینی هستند که از برهمکنش نامناسب سایر مولکول های پروتئینی جلوگیری میکنند. در نتیجه چاپرون مانع تجمع و رسوب پروتئینها در داخل سلول میشود (Ehrnsperger و همکاران 1997).
مولکولهای چاپرون به تاخوردگی صحیح و طبیعی سایر پروتئینها کمک میکنند. خانواده های پروتئینی متفاوتی با فعالیت چاپرونی شناسایی شدهاند. در سلولهای یوکاریوتی مولکولهای چاپرون اغلب در داخل شبکهی آندوپلاسمی و سیتوزول یافت میشود. در سیتوزول بیشترین میزان سنتز و انتقال پروتئین انجام میشود تا از تاخوردگی صحیح پروتئینها اطمینان حاصل شود (Ellis و همکاران 1996، Ruddon و همکاران 1997). تنشهای فیزیولوژیکی مانند گرما و تنشهای اکسایشی بیان مولکولهای چاپرون را 10 تا 20 برابر افزایش میدهد. همچنین مطالعات گذشته نشان میدهد که هم توالی کد کنندهی پروتئین و هم توالی تنظیمی در ژن مولکولهای چاپرونی به شدت حفاظت شده است (Ingolia و همکاران 1980، Hunt و همکاران 1985، Corces و همکاران 1980، Lindsquist و همکاران 1986).
مطالعات پیشین نشان میدهد که کازئین بتا، کازئین کاپا و بخصوص کازئینهای آلفا S1 و آلفا S2 دارای فعالیت چاپرونی هستند (Humphreys و همکاران 1999). کازئینها در شیر از تجمع و رسوب پروتئینهای آب پنیر در اثر حرارت جلوگیری میکنند (Morr و همکاران 1968، Zhang و همکاران 2005، Barzegar و همکاران 2008). حضور گروههای فسفات نقش مهمی در فعالیت چاپرونی کازئینها دارد. حذف این گروهها از کازئینهای آلفا و بتا باعث کاهش توانایی آنها در جلوگیری از واسرشته شدن، تجمع و رسوب پروتئینهای هدف می شود ( Matsudomi و همکاران 2004، Koudelka و همکاران 2009).

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

1-4-2- پپتید های فعال زیستی
1-4-2-1- پپتید های فعال زیستی
پپتیدهایی که در محیط آزمایشگاهی یا در بدن موجودات زنده به وسیله آنزیمهای آبکافت کننده از هضم ناقص پروتئینها ایجاد و دارای عملکرد زیستی یا تاثیر فیزیولوژیک خاص باشند را اصطلاحا پپتیدهای فعال زیستی19 مینامند. این پپتیدها میتوانند از پروتئینهای باکتریایی، گیاهی و یا جانوری بدست آیند.
از جمله عملکردهای زیستی این پروتئینها میتوان به خاصیت کاهندگی فشارخون، خاصیت آنتیاکسیدانی، فعالیت ضد میکروبی، توانایی انتقال مواد معدنی و خاصیت ضد سرطانی آنها اشاره کرد (Bruck و همکاران 2002).
پپتیدهای فعال زیستی زمانی که در ساختار پروتئین قرار دارند ممکن است هیچ نوع فعالیت زیستی از خود نشان ندهند اما پس از آبکافت پروتئین بوسیله پروتئازها و آزاد شدن قطعات پپتیدی خواص زیستی آنها آشکار میشود (Korhonen و همکاران2006).
1-4-2-2- منابع اصلی پپتیدهای فعال زیستی
از منابع غنی پپتیدهای فعال زیستی میتوان به تخم مرغ، شیر و به میزان کمتر گوشت برخی از حیوانات مانند ماهی و برخی از پروتئینهای گیاهی مانند سویا اشاره کرد (Korhonen و همکاران 2003، Eedmann وهمکاران 2008).
1-4-2-3- برخی از خواص پپتیدهای فعال زیستی
1-4-2-3-1- خاصیت ضد فشار خون
فشار خون بالا یک عامل خطرناک برای بیماریهای قلبی-عروقی از جمله بیماری عروق کرونر قلب و سکتههای مغزی محسوب می شود. در بدن انسان سیستمی با نام سیستم رنین- آنژیوتنسین تنظیم فشار خون را بر عهده دارد.
آنژیوتنسین-I پروتئینی است که از پیشسازی با نام آنژیوتنسینوژن20 در کبد ساخته و به خون رها میشود. در خون آنزیم رنین21 این پیش ساز را به آنژیوتنسین-I تبدیل میکند. آنژیوتنسین-I وارد شش شده و در آنجا بوسیله آنزیم ACE22 به آنژیوتنسین-II یعنی شکل فعالتر آن تبدیل میشود. آنزیمهای آنژیوتنسین-I وII قطر عروق خونی را کاهش میدهند و بدین ترتیب فشار خون را بالا میبرند. بنابراین هر ترکیبی که بتواند از فعالیت این سیستم یا آنزیم ACE جلوگیری کند به درمان فشار خون کمک مینماید (Laplaize و همکاران 2003،Jingbo و همکاران 2010، Guan-Hong و همکاران 2005).
شکل1-5- نمایی از سیستم رنین- آنژیوتنسین به عنوان سیستم مهم تنظیم کننده فشار خون.
مطالعات پیشین نشان میدهد برخی از پپتیدهای حاصل از آبکافت آنزیمی پروتئینهای شیر از جمله کازئینها و پروتئینهای آب پنیردارای خاصیت مهار آنزیم ACE میباشند.
به عنوان مثال پپتیدهای مشتق شده از کازئینهای شیر گاو با نام کازوکینین23 که شامل توالیهای 21 تا 23، 23 تا 34 و 194تا 199 ازکازئین آلفا S1، توالی 177 تا 183 کازئینبتا دارای خاصیت مهار آنزیم ACE است (Maruyama وهمکاران 1982-1985).
برخی از پپتیدهای حاصل از پروتئینهای آب پنیر نیز مهار کنندهی آنزیم ACE میباشند. به عنوان مثال توالی پپتیدی 142 تا 148 بتا لاکتوگلوبولین مهار کنندهی قوی آنزیم ACE در محیط آزمایشگاهی میباشد (Laplaize و همکاران 2003).
مطالعات زیادی بر روی رابطهی بین ساختار و فعالیت مهار آنزیم ACE پپتیدهای مهار کنندهی این آنزیم انجام شده است. این مطالعات نشان میدهد که انتهای C این پپتیدها نقش مهمی در اتصال آنها به آنزیم ACE دارد.
همچنین این بررسیها نشان میدهد که پپتیدهای که در انتهای C خود دارای آمینواسیدهای آبگریز مانند تریپتوفان، تیروزین، فنیلآلانین و پرولین هستند توانایی بالایی در مهار آنزیم ACE از خود نشان میدهند (Cheung و همکاران 1984).
1-4-2-3-2- فعالیت آنتی اکسیدانی
مطالعات پیشین نشان میدهد بسیاری از بیماریها ازجمله آلزایمر، دیابت، سختی شریانهای خون، ورم مفاصل و سرطان رابطهی معنی داری با میزان استرسهای اکسایشی، حضور رادیکال های آزاد24 و گونههای فعال اکسیژنی25 دارد. این ترکیبات که میتواند از محیط خارج وارد بدن فرد شود و یا نتیجهی فرآیندهای متابولیکی داخل سلول باشد با آسیب رساندن به بخشهای مختلف سلول مانند چربیهای موجود در غشای سلول، پروتئینها و DNA سلول باعث اختلال در عملکرد آن میشود و میتواند سلول را به سمت مرگ برنامهریزی شده سلولی26 و یا سرطانی27 شدن ببرد.
امروزه در بسیاری از صنایع از جمله در صنایع غذایی، صنایع آرایشی و دارویی از ترکیبات آنتیاکسیدان مصنوعی برای جلوگیری از اکسایش مواد سازنده استفاده میشود که خود این ترکیبات مصنوعی عوارض جانبی مختلفی را ایجاد میکنند. بنابراین جایگزینی این ترکیبات با آنتیاکسیدانهای طبیعی بسیار حائز اهمیت است (Abuja و همکاران 2001، Liu و همکاران 2003، Okada و همکاران 1998، Collins و همکاران 2005).
بررسیها نشان میدهد که پپتیدهای مشتق شده از کازئین آلفا دارای توانایی مهار رادیکال های آزاد و جلوگیری از پراکسیداسیون آنزیمی و غیرآنزیمی لیپیدها میباشند (Rival و همکاران 2001).
1-5- مشکلات ناشی از مصرف شیر در افراد
1-5-1- عدم تحمل لاکتوز
عدم تحمل لاکتوز نتیجهی ناتوانی در هضم قند شیر اغلب به علت کمبود یا نبود آنزیم لاکتاز28 رودهای میباشد که با علائمی همچون نفخ، دردهای شکمی، اسهال و استفراغ همراه است.
آنزیم لاکتاز رودهای قند دیساکارید شیر را به دو قند ساده گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند که این مونوساکاریدها بوسیله سلولهای روده قابل جذب هستند (Cuatrecasas و همکاران 1965، Huang و همکاران 1968).
کمبود آنزیم لاکتاز اغلب به دو صورت در افراد بروز میکند:
1- آنزیم یا به صورت جزئی و یا به طور مطلق در افراد تولید نمیشود و کمبود آنزیم لاکتاز به صورت مادر زادی بسیار نادر است.
2- در مواردی نیز آسیب به مخاط رودهی کوچک باعث کاهش میزان این آنزیم و در نتیجه اشکال در هضم لاکتوز شیر میشود.
توصیههای درمانی که برای افراد مبتلا به عدم تحمل لاکتوز وجود دارد، معمولا استفاده نکردن از فراوردههای لبنی یا کاهش مصرف این فراوردهها است. همچنین استفاده از فرآورده های لبنی که لاکتوز آنها بطور کامل حذف شده است راه حلی است که به وسیلهی زیست- فناوری29 ارائه شده است. همچنین افزودن آنزیم لاکتاز به شیر میتواند با شکستن لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز از ایجاد عوارض ناشی از عدم هضم لاکتوز در افرادی که قادر به هضم این دی ساکارید نیستند جلوگیری کند.

1-5-2- آلرژی به پروتئین های شیر
بین2 تا 7درصد کودکان به شیر گاو آلرژی30 نشان میدهند که 60 تا70درصد آنها در سال دوم زندگی و 84 تا 87 درصد آنها در سال سوم بهبود مییابند. در آلرژی به شیر گاو سیستم ایمنی دخالت دارد و از اینرو با عارضهی عدم تحمل لاکتوز متفاوت است (Caffarelli و همکاران 2010).
آنتیژن31 مولکولی است که اغلب سیستم ایمنی را وادار به پاسخ گویی اختصاصی با استفاده از آنتیبادی میکند. بخشی از مولکول آنتیژن که بوسیله مولکول آنتیبادی شناسایی و به آن متصل میشود اصطلاحا اپیتوپ32 نام دارد که در مورد پروتئینها میتواند به دو صورت اپی توپ خطی33 (توالی آمینو اسیدی) و اپیتوپ ساختار فضایی34 (ساختار سوم پروتئین ) باشد.
شکل1-6- نمایی از انواع اپیتوپهای خطی و فضایی پروتئینی.
پاسخ سیستم ایمنی به پروتئینهای شیر به عنوان آنتیژن بر اساس میزان حساسیت فرد میتواند از انواع بسیار خفیف تا شوک آنافیلاکسی و مرگ متفاوت باشد. معمولا آلرژی به شیر گاو سه دستگاه گوارش، تنفس و پوست را درگیر میکند (Baehler و همکاران 1996، Salvatore و همکاران 2002، Host و همکاران1994، Heine و همکاران2002).

شکل1-7- علائم حساسیت به شیرگاو.
به علت طیف وسیع علائم تشخیص، آلرژی به شیر در کودکان یکی از چالشهای پزشکی محسوب میشود. در صورتی که آلرژی کودک به شیر ثابت شود کودک و مادر هر دو از مصرف شیر و فراورده های لبنی منع میشوند که این خود میتواند باعث کمبود انواع ویتامین و مواد معدنی در زمان رشد کودک شود و او را به انواع بیماریها از جمله راشیتیسم مستعد میکند.
یکی از روشهایی که به وسیله آن میتوان میزان حساسیت35 به شیر را در نوزادان کاهش داد، آبکافت36 ناقص پروتئینهای شیر میباشد. امروزه انواع مختلفی از این نوع شیرها در بازار برای مصرف وجود دارد. البته این روش نیز به طور کامل موثر نیست و بهترین راه برای جلوگیری از خطرات ناشی از مصرف شیر در کودکان عدم مصرف شیر توسط مادر و کودک محسوب می شود (Jarvinen و همکاران 1999، Terheggen-Lagro و همکاران 2002، Sampson و همکاران1991).
1-5-2-1- معرفی انواع آزمونهای رایج جهت مطالعهی فرآیند آلرژی
برای تشخیص آلرژی یا آزمونهای پوستی و یا از خون فرد بیمار استفاده میشود (Garcia-Ara و همکاران 2001، Canani و همکاران 2007). در آزمون پوستی قسمتی از پوست بیمار پس از خراش پوستی با یک وسیلهی نوک تیز مقداری از آنتیژن با آن ناحیه تماس داده می شود و از روی قطر ناحیه التهاب و اندازه تاول میزان حساسیت فرد سنجیده میشود (Yuen و همکاران 2007).
شکل1-8- آزمون خراش پوستی برای تعیین میزان حساسیت فرد به مادهی آلرژی زا.
در آزمونهای خونی که بسیار اختصاصی تر از آزمون پوستی است نمونه سرم خون بیمار که دارای آنتیبادی علیه آلرژن خاص میباشد استفاده میشود. معمولا از روش الایزا37 برای انجام آزمونهای خون استفاده میشود که میتواند به صورت رنگسنجی یا اندازهگیری نشر فلورسانس38 و لومینسانس39 انجام شود.
1-5-2-2- آزمون الایزا
از این روش میتوان برای تشخیص یک آنتیبادی اختصاصی که بر علیه یک آلرژن خاص ترشح شده استفاده کرد. آزمون الایزا به روشهای مستقیم40، غیرمستقیم41، ساندویچی42 و رقابتی43 انجام میگیرد که در زیر روش غیرمستقیم که در این پژوهش استفاده شد، شرح داده شده است.
در روش الایزای غیرمستقیم، مادهی آلرژن به چاهکهای پلیت 96 خانه ایی الایزا اضافه میشود. سپس پلیت در یک مدت زمان خاص (معمولا به صورت یک شبانه روز در 4 درجهی سانتیگراد) انکوبه میشود. پس از پایان مدت زمان انکوبه پلیت را با بافر شستشو (بافر فسفات سالین حاوی تووین)، 3 مرتبه شستشو میدهند تا آلرژنهایی که به آنتیبادی متصل نشده از چاهک خارج شود. در مرحلهی بعد سرم بیمار به چاهکها افزوده میشود و پلیت مجددا به صورت یک شبانه روز در دمای 4 درجهی سانتیگراد انکوبه میگردد. پس از پایان مدت زمان انکوبه و شستشوی پلیت، آنتیبادی ثانویه که به یک آنزیم (معمولا پراکسیداز یا آلکالین فسفاتاز) متصل است به چاهکها اضافه شده و پلیت به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجهی سانتیگراد در بن ماری انکوبه میگردد. در مرحلهی بعد، سوبسترای آنزیم به چاهکها اضافه و پلیت به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجهی سانتیگراد انکوبه میشود. در نهایت محلول متوقف کنندهی واکنش به چاهکها اضافه شده و میزان جذب یا نشر در یک طولموج خاص خوانده میشود.
1-6- قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها
قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها اولین بار در سال 1912 به وسیلهی میلارد شرح داده شد. در این واکنش گروه کربونیل قند احیا کننده با گروههای آمین آزاد آمینواسیدهای پروتئین از جمله اپسیلون آمینواسید لیزین، آمینواسیدهای آرژنین و هیستیدن و آمین آلفای انتهای N پروتئین واکنش میدهد.
واکنش میلارد طی 3 مرحله انجام میشود:
مرحلهی اول: حملهی نوکلئوفیلی گروه آمین آزاد پروتئین به گروه کربونیل قند و تولید حدواسطهای ناپایداری به نام بازشیف است که طی یک مرحله نوآرایی ساختاری، گلوسیتول و کتوآمین (محصول آمادوری) را تولید میکنند.
مرحلهی دوم: شامل تبدیل محصولات آمادوری از طریق واکنشهای اکسایش-کاهش به ترکیبات کربونیلی بسیار واکنش پذیر میباشد.
مرحلهی سوم: واکنش ترکیبات کربونیلی با زنجیرههای جانبی نوکلئوفیلی آمینواسیدهای همان پروتئین یا پروتئینهای مجاور و ایجاد ترکیبات بسیار سمی پایدار به نام محصولات پیشرفتهی واکنش میلارد44 (AGE) است (Lapolla و همکاران 2005، Miura و همکاران 2003).
حضور ترکیبات احیاکننده در محیط میتواند سرعت تولید ترکیبات حدواسط بازشیف را افزایش داده و به طور انتخابی مسیر واکنش را به سمت تولید گلوسیتول پیش ببرد و محصولات کتوآمین (آمادوری) کمتری نسبت به شرایط غیراحیایی تولید شود (Watkins و همکاران 1985).
مطالعات پیشین نشان میدهد قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها با تغییرات ساختاری و عملکردی پروتئین همراه است. از آنجایی که بسیاری از این تغییرات با بیماریهای مختلف از جمله آلزایمر، پارکینسون، سرطان و بیماریهای قلبی-عروقی در ارتباط هستند و همچنین تغییرات ساختاری پروتئینهای مواد غذایی باعث تغییر رنگ، طعم، بو و مزهی این مواد میشود، بررسی فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی از اهمیت زیادی برخوردار است. مطالعات فراوانی روی فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای مختلف از جمله پروتئینهای شیر انجام شده است.
شیر به عنوان یک مادهی غذایی غنی از پروتئین، کربوهیدرات و ترکیبات احیا کنندهایی مانند ویتامینهای E و C محیط مناسبی را برای قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها در شرایط احیایی فراهم میکند. مطالعات پیشین نشان میدهد فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئین های شیر بر روی خواص مختلف این پروتئینها از جمله خواص فیزیکی، شیمیایی، بیوشیمیایی و عملکردهای زیستی آنها تاثر قابل توجهی دارد. به عنوان مثال Lee در سال 1979 نشان داد قندی شدن غیرآنزیمی کازئینهای شیرگاو با کاهش ارزش تغذیهایی و قابلیت هضم این پروتئینها همراه است. همچنین Sun در سال 2005 نشان داد قندی شدن غیرآنزیمی آلفا-لاکتالبومین شیرگاو باعث افزایش توان مهار رادیکالهای آزاد و خاصیت آنتیاکسیدانی این پروتئین میشود.

فصل دوم
مروری بر پژوهشهای پیشین
تحقیقات گستردهایی روی پروتئینهای شیر قندی شده به روش غیرآنزیمی، در گونههای مختلف حیوانات از جمله گاو انجام شده است. این تحقیقات به منظور بررسی تغییرات ساختاری، عملکردی و فعالیتهای زیستی و همچنین استفاده از این پروتئینهای قندی در صنایع غذایی برای بهبود خاصیت امولسیونی، ژلهایی شدن، عطر، طعم، ظاهر و بافت مواد غذایی صورت گرفته است (Honda و همکاران 1999، Nakamura و همکاران1992).
در سال 2003 Maleki و همکاران و همچنین در سال 2005 Grube و همکاران بر روی خواص آنتیاکسیدانی پروتئینهای بادامزمینی که به روش غیرآنزیمی قندی شده بود مطالعاتی انجام دادند. نتیجهی این مطالعات نشان داد که قندی شدن غیرآنزیمی باعث افزایش خاصیت آنتیاکسیدانی این پروتئینها میشود. همچنین Chung و همکاران در سال 2001 نشان دادند که مقادیر محصولات نهایی واکنش میلارد (AGE) در بادام زمینی حرارت دیده دو برابر بادام زمینی خام است.
نتایج بسیاری از مطالعات پیشین نشان میدهد که قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینهای شیر، باعث بهبود خاصیت آنتیاکسیدانی (Hayase و همکاران 1990، Rufian- Henares2007، Sun 2004)، آنتی باکتریایی (Rufian-Henares و Morales 2006، 2008) افزایش توانایی ضد فشارخون (Rufian-Henares و Morales 2007) ضد سرطانی (Tsai و Yen 1993) آنها میشود.
تاثیر فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی بر روی سرمآلبومین گاوی به وسیلهی Ledesma-Osuna در سال 2008 و با استفاده از قندهای گلوکز، گالاکتوز و لاکتوز مطالعه شد.
در سال 2006Sun تغییرات شیمیایی و فعالیت آنتیاکسیدان آلفالاکتالبومین قندی شده به وسیلهی قندهای آلوز، گلوکز و فروکتوز را بررسی کرد، نتایج این تحقیق افزایش خاصیت آتنیاکسیدانی آلفالاکتالبومین را بعد از قندی شدن نشان میداد.
همچنین در سال 2005 تاثیر قندی شدن بر روی حلالیت و پایداری گرمایی بتالاکتوگلوبولین به وسیلهی Jimenez-Castano مطالعه شد.
در سال 2009 GUتاثیر زمان گرمادهی، دما و pH را بر روی خواص امولسیونی و آنتی اکسیدانی کازئینهای قندی شده با گلوکز به روش غیرآنزیمی مورد مطالعه قرار داد و اثر قندی شدن غیرآنزیمی برروی پایداری، خاصیت امولسیونی، پایداری گرمایی بتالاکتوگلوبولین که با قندهای آرابینوز، گالاکتوز، گلوکز، لاکتوز، رامنوز و ریبوز به روش غیرآنزیمی قندی شده بود، به وسیلهی Chevalier در سال 2001مطالعه شد.
Jing تغییرات شیمیایی و بیوشیمیایی کازئینهای قندی شده به روش غیرآنزیمی را در سال 2002 مطالعه کرد. وی همچنین در سال 2004 اثر واکنش میلارد بر روی خواص شیمیایی و سمیت کازئینهای قنده شده بر روی 2 رده سلولی Caco-2 و Int-407 را بررسی نمود.
همچنین Lee در سال 1979 تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی احیایی را بر روی ارزش غذایی و قابلیت هضم کازئینها به وسیلهی آنزیمهای پانکراس مطالعه کرد. نتایج این بررسی نشان داد قندی شدن با کاهش ارزش غذایی و قابلیت هضم این پروتئینها همراه است.
در سال 2011 Mahran تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی را بر روی کازئینهای شیر بوفالو بررسی کرد. Aminlari و همکاران در سال 2005 نشان داد که قندی شدن غیرآنزیمی
کازئینها باعث افزایش پایداری این پروتئینها در pH و دماهای مختلف میشود. همچنین قندی شدن این پروتئینها با افزایش پایداری حرارتی و بهبود خاصیت امولسیونی آنها همراه است.
Darewicz در سال 1998 اثر قندی شدن غیرآنزیمی احیایی را بر روی خواص فیزیکوشیمیایی کازئینبتا شیر گاو از جمله نقطه ایزوالکتریک، وزن مولکولی، تحرک الکتروفورتیک و تغییرات ساختاری، بررسی کرد که نتایج این مطالعه نشان داد، قندی غیرآنزیمی کازئینبتا با افزایش نقطهی ایزوالکتریک و وزن مولکولی، بهبود تحرک الکتروفورتیک و افزایش پایداری حرارتی و تغییر حساسیت در هضم به وسیلهی آنزیم تریپسین همراه است.
اهداف این پژوهش
شیر به علت داشتن درصد بالایی از قندها و ترکیبات احیا کننده مانند ویتامینهای E و C محیط مناسبی را برای قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها در شرایط احیایی فراهم میکند. عملکرد صحیح پروتئینها از جمله پروتئینهای شیر به حفظ ساختار طبیعی آنها بستگی دارد. مطالعات پیشین نشان میدهد که قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها با تغییر ساختار، عملکرد، خواص فیزیکی، شیمیایی و بیوشیمیایی آنها همراه است. همچنین این پژوهشها نشان میدهد بسیاری از بیماریها مانند آب مروارید، پارکینسون، آلزایمر و گرفتگی عروق خونی ارتباط مستقیمی با فرآیند قندی شدن غیرآنزیمی پروتئینها دارند. لذا بررسی این فرآیند از نظر پزشکی و تغذیهایی دارای اهمیت بسیار زیادی میباشد. از اینرو مطالعهی تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی در شرایط احیایی (شرایطی مانند محیط داخل شیر) بر روی ساختارهای دوم و سوم پروتئین و فعالیتهای زیستی از جمله فعالیت آنتیاکسیدانی، چاپرونی و مهار آنزیم ACE همچنین بررسی تاثیر قندی شدن غیرآنزیمی بر میزان آلرژیزایی پروتئینهای شیرگاو و کازئینبتا از اهداف اصلی این پژوهش میباشد.

فصل سوم
مواد و روشهای تحقیق
3-1- مواد مصرفی
پودراستون شش خرگوش حاوی آنزیم (ACE)، آنزیم کیموتریپسین (EC.3.4.21.1)، آنزیم تریپسین (EC.3.4.21.4)، بافر سدیم استات، 2و2-آزینوبیس (3- اتیل بنزوتیازولین-6- سولفونیک اسید) (ABTS)، اوره، EDTA، بتامرکاپتواتانول، سدیمآزید، آنتیبیوتیک پنیسیلین/استرپتومایسین، DEAE- سلولز، کیسه دیالیز، سرم بیماران آلرژیک به شیرگاو، قند گلوکز، قند لاکتوز، اُ- فتالدهید (OPA)، پلیت الایزای 96 خانهایی،Tween-20 ، غشای UF45، فلورسامین، پتاسیم پرسولفات، ترییس، گلیسرول، 1- آنیلینو-8- نفتالین سولفونات (ANS)، N-فورناکریلولیل-1- فنیلآلانیلگلایسیلگلایسین (FAPGG)، انسولین، هموگلوبین، ایمیدازول، سدیم کلرید، سدیم سیانوبوروهیدرات (NABH3CN).
3-2- تهیهی محلولها
3-2-1- تهیهی محلولهای کازئینی، بتا کازئین و تعیین غلظت آنها
برای تهیهی محلول کازئینی و بتاکازئین مقدار معینی از پودر این پروتئین در بافر فسفات 100 میلیمولار با 4/7 PH حل میشود. پس از انحلال کامل پروتئین در بافر، محلول کازئینی با استفاده از روش برادفورد وثبت جذب در طولموج 595 نانومتر، همچنین محلول بتاکازئین به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر وثبت جذب در طوج موج 280 نانومتر و با استفاده از معادلهی بیرلامبرت46 (3-1) تعیین غلظت میشود.
معادله 3-1 A= ε.C.L
در این معادله A میزان جذب، ε ضریبجذب مولی نمونه، C غلظت نمونه و L طول مسیرطی شده بوسیلهی نور است که معمولا 1 سانتیمتر در نظر گرفته میشود. هر پروتئین ضریبجذب مولی مخصوص به خود را دارد.

3-2-2- تهیهی محلول برادفورد و رسم نمودار استاندارد آن با استفاده از کازئین بتا
برای تهیهی محلول برادفورد 10 میلیگرم از پودر کوماسی بلو G-250 در 5 میلیلیتر اتانول 95 درصد حل میشود و پس از انحلال کامل پودر در اتانول 10 میلیلیتر اسید فسفریک 80 درصد به آن اضافه میشود و مجددا آن را روی دستگاه همزن قرار میدهیم. در ادامه حجم محلول را با آب مقطر به 100 میلیلیتر میرسانیم و در پایان با استفاده از کاغذ صافی واتمن محلول فوق را دو بار فیلتر کرده و در یک ظرف تیره در یخچال (دمای 4 درجه سانتیگراد) تا زمان استفاده نگهداری میکنیم.
برای رسم منحنی استاندار برادفورد با استفاده از کازئینبتا از جدول زیر استفاده میشود.
جدول3-1- رسم منحنی استاندار برادفورد با استفاده از کازئینبتا (1 میلیگرم بر میلیلیتر) به عنوان پروتئین استاندارد.
جذب برادفورد نمونه در طولموج 595 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر خوانده میشود. قبل از خواندن جذب نمونه باید دستگاه با نمونه شمارهی 1 که حاوی 1 میلی لیتر برادفور و 100 میکرولیتر آب مقطر است صفر شود. سپس جذب نمونهها در طولموج 595 نانومتر ثبت میشود و با کمک نرمافزار Excel معادله خط و مقدارR2 به دست
میآید. از این معادلهی خط به منظور تعیین غلظت نمونههای پروتئینی مجهول استفاده
میشود.

دسته بندی : پایان نامه ارشد

پاسخ دهید