معاونت پژوهش و فناوري
منشور اخلاق پژوهش
با ياري از خداوند سبحان و اعتقاد به اين که عالم محضر خداست و همواره ناظربر اعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهميت
جايگاه دانشگاه در اعتلاي فرهنگ و تمدن بشري ، ما دانشجويان و اعضاء هيات علمي واحدهاي دانشگاه آزاد اسلامي متعهد ميگرديم اصول زير را در انجام
فعاليت هاي پژوهشي مد نظر قرار داده و از آن تخطي نکنيم:
1-اصل برائت : التزام به برائت جويي از هرگونه رفتار غير حرفهاي و اعلام موضع نسبت به کساني که حوزه علم و پژوهش را به شائبههاي غير علمي ميآلايند.
2- اصل رعايت انصاف و امانت : تعهد به اجتناب از هرگونه جانب داري غير علمي و حفاظت از اموال ، تجهيزات و منابع در اختيار.
3- اصل ترويج : تعهد به رواج دانش و اشاعه نتايج تحقيقات و انتقال آن به همکاران علمي و دانشجويان به غير از مواردي که منع قانوني دارد .
4- اصل احترام : تعهد به رعايت حريمها و حرمتها در انجام تحقيقات و رعايت جانب نقد و خودداري از هرگونه حرمت شکني.
5-اصل رعايت حقوق : التزام به رعايت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهيدگان ( انسان ، حيوان و نبات ) و ساير صاحبان حق .
6- اصل رازداري: تعهد به صيانت از اسرار و اطلاعات محرمانه افراد ، سازمانها و کشور و کليه افراد و نهادهاي مرتبط با تحقيق.
7- اصل حقيقت جويي : تلاش در راستاي پي جويي حقيقت و وفاداري به آن و دوري از هرگونه پنهان سازي حقيقت.
8-اصل مالکيت مادي و معنوي : تعهد به رعايت کامل حقوق مادي و معنوي دانشگاه و کليه همکاران پژوهش.
9- اصل منافع ملي : تعهد به رعايت مصالح ملي و در نظر داشتن پيشبرد و توسعه کشور در کليه مراحل پژوهش
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد
در رشته بيوشيمي
عنوان:
تغييرات فعاليت سطح سرمي آنزيم پاراکسوناز 1 به دنبال آسيب هاي ناشي از سوختگي حرارتي
استاد راهنما:
دکترسعيد صفري
استاد مشاور:
دکتر بستان رودي
دکتر افشين اميني
نگارش:
محسن پرورشي همراه
تابستان1394
فهرست مطالب
توپولوژي عموم 3
اصول جداسازي8
ترکيبيات 9
2 تعداد توپولوژي هاي روي يک مجموعه متناهي
توپولوژي هايي باکمترين تعداد از مجموعه هاي با14
توپولوژي ها بابيشترين تعداد مجموعه هاي باز 14
3 تعداد توپولوژي هاي محدب روي يک مجموعه متناهي ترتيب کلي
3-1 توپولوژي هاي محدب آشيانه اي…………………………………………………………………………………………………………………..32
3-2 Tcvx(n)……………………………………………………………………………………………………………………………………………………35
4 اندازه کمين ممکن براي يک مجموعه تحت يک توپولوژي معين
4-1 به دست آوردن تعداد(n, k) T 41
4-2 شرح ماشيني44
4-3 کران هاي نمايي 49
4-4 معين کردن اندازه مينيمال مجموعه57
4-5 کارايي بهتر58
4-6 مقايسه نوع ديگري از دنباله ها60
مراجع
واژه نامه فارسي به انگليسي 65
واژه نامه انگليسي به فارسي67

فهرست جدول ها
3-1 TNest(n, k)تعدادي از توپولوژي ه اي روي يک مجموعه-n نقطه اي ترتيب کلي شامل مجموعه محدب آشيانه اي است33
3-2 تعداد Tcvx(n) و Tnest(n) از توپولوژي محدب آشيانه اي و توپولوژي محدب روي يک مجموعه ي ترکيب کلي -n نقطه اي، و تعداد T(n) از توپولوژي روي يک مجموعه ي -n نقطه است40
4-1 تعدادي از اعداد مينيمال از نقاط m(k) هستند که براي ساختن يک توپولوژي داراي k مجموعه باز در محاسباتي در (27) به ازاي ]2, 2? k ? [ نياز داريم44
4-2 مقادير f(n)را به ازاي 10 n?بدست مي آوريم ، در سطر پايين اندازه اندازه کوچکترين توپولوژي که بيشتر از 1 است، با استفاده از قضيه بالا بدست نمي آيد، در اين صورت 4/(2- (n23از قضيه بالا بدست مي آيد، واعداد بدست امده را براي اينکه به اعداد صحيح تبديل شوند، به سمت پايين روند مي کنيم44
فهرست شکل ها
گراف جهتدار رابطهR…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..8
2-1 شبکه اي از مقسوم عليه هاي عدد صحيح 60 است که به صورت مرتب تقسيم شده است………………………………………………………….14
2-2 شبکه اي از ريز مجموعه هاي {x, y, z}………………………………………………………………………………………………………………………………………….15
1……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….19
2………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………20
شکل هاي توپولوژي براي) ,16 T(n ………………………………………………………………………………………………………………………………….21
شکل هاي توپولوژي براي) ,16 T(n …………………………………………………………………………………………………………………………………….22
4………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………26
5………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………28
6………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….28
3-1 يک نمونه از توپولوژي روي(8و1) است……………………………………………………………………………………………………………………………………………….37
3-2 در مثال ممکن است نقطه اضافه شده به خارج همسايگي ها شامل هيچ يک از همسايگي ها نباشد يا خارج دوتا همسايگي باشد و شامل يک همسايگي و همچنين امکان دارد شامل سه همسايگي باشد……………………………………………………………………………………………………….38
3-3 امکان انتخاب براي MN(9) وجود دارد اگر همسايگي مينيمال MN(J) بسطي براي
(8و1)j ? نباشد…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………38
3-4 امکان انتخاب براي MN(9) وجود دارد اگر MN(2)و MN(6) بسطي شامل 9 باشند…………………………………………………………………………39
4-1 مجموعه ترتيب جزئي) P(T° مربوط به توپولوژي القاء شده T° به وسيله توپولوژيT در مثال2.4 اس
4-2 شيوه قضيه 3.3 به ازاي K=105که در آن K2=1101001 است……………………………………………………………………………………………………………51
4-3 شيوه قضيه 7.3 به ازاي K=5550 که در آن K2=1010110101110 دوگان ايده آل مرتب يکريخت به • ?• است، که به وسيله روش دايره اي تعريف مي کنيم. …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………54
4-4 يک روش کارا براي ساختن يک مجموعه ترتيب جزئي با 65535 پادزنجير با استفاده از 19 عنصر است59
4-5 شيوه قضيه 3.3 را براي K=4681 بکار مي بريم………………………………………………………………………………………………………………………………………60
چکيده :
مقدمه: سوختگي با واکنش هاي التهابي و توليد راديکال آزاد از جمله ROS و RNS و کاهش سيستم ايمني بدن همراه است. بنابراين اين مطالعه به منظور بررسي استرس اکسيداتيو و آنزيم پاراکسوناز (PON1) به عنوان يک شاخص آنتي اکسيداني در بيماران دچار آسيب سوختگي حرارتي و مقايسه با افراد سالم طراحي شد. مواد وروش ها: در اين مطالعه مورد شاهدي 57 بيمار سوختگي حرارتي که در بخش اورژانس بستري شده بودند و حداکثر 4 ساعت از سوختگي آنها گذشته شده بود به عنوان مورد و 57 فرد سالم که از نظر سن و جنس با گروه مورد همسان سازي شد به عنوان کنترل وارد مطالعه شد .فاکتور هاي بيوشيميايي، علائم حياتي و فعاليت آنزيم پاراکسوناز (PON1) در هر دو گروه مورد بررسي قرار گرفت. نتايج: ارزيابي هاي کلينيکي و آزمايشگاهي در افراد مورد مطالعه نشان داد تعداد ضربان قلب (04/0=p)، تعداد تنفس (001/0>p)، سطح گلبول سفيد خون (001/0>p)، سطح پلاکت پلاسما (03/0=p)، سطح قند ناشتاي خون (001/0>p)، سطح کلسترول تام (007/0=p)، سطح HDL (001/0>p)، سطح SGOT (001/0>p)، سطح SGPT (01/0=p)، سطح پتاسيم (001/0>p)، سطح کلسيم (04/0=p) و سطح آلبومين سرمي (001/0>p) اختلاف معني داري بين دو گروه دارد. شايان ذکر است سطح فعاليت پاراکسوناز در گروه دچار سوختگي حرارتي به طور معني داري کمتر از گروه کنترل بود (001/0>p). يافته هاي مطالعه حاضر نشان داد حتي پس از تعديل آناليزها براي فاکتورهاي احتمالي تاثير گذار بر سطح پاراکسوناز شامل سطح HDL، فعاليت کبدي، مصرف دخانيات و سطح آلبومين پلاسما رابطه معني داري بين سطح پاراکسوناز و سوختگي وجود دارد بدين مفهوم که سطح اين آنزيم پلاسمايي در بيماران دچار سوختگي کمتر از افراد سالم مي باشد (03/0=p). نتيجه گيري: بررسي سطح فعاليت اين آنزيم مي تواند به عنوان يک بيومارکر در ارزيابي شدت ضايعات دراز مدت ناشي از سوختگي و يا حتي يک نقطه درماني مفيد باشد. با توجه به اينکه مي توان پاراکسوناز جهش يافته با فعاليت و حلاليت متفاوت توليد نمود که پتانسيل توليد واريته هاي از پاراکسوناز با فعاليت بالاتر در حذف پراکسيد هاي ليپيدي و يا فعاليت بيشتر عليه سموم ارگانوفسفات دارند. لذا با انجام تحقيقات بيشتر در اين زمينه مي توان اميدوار بود که سنجش فعاليت پاراکسوناز جهت پيش آگهي بيماران دچار آسيب سوختگي حرارتي در نظر گرفته شود.
هدف از مطالعه
در افراد نرمال، تعادل بين آنتي اکسيدن ها و اکسيدان ها وجود دارد. افزايش در غلظت اکسيدان ها يا افت آنتي اکسيداني منجر به ازدست رفتن اين تعادل و به وجود آمدن حالتي به نام استرس اکسيداتيو مي شود به نظر مي رسد استرس اکسيداتيو نقش مهمي در پاتوژنر بيماري آسب سوختگي از طريق آسيب مستقيم، يا درگير کردن مکانيسم هاي مولکولي موثر در التهاب بافتي داشته باشد. راديکال هاي آزاد بواسطه شروع وقايعي که منجر به تخليه آنتي اکسيداني مي شود سبب القا استرس اکسيداتيو مي شود.
آنزيم PON 1 که برروي HDL واقع مي باشد مسئول هيدروليز پراکسيد هاي ليپيدي و بنابراين محافظت در برابر استرس اکسيداتيو ايفا کند. فعاليت و پلي مورفيسم PON1 بر توانايي HDL افراد در جلوگيري از التهاب موثر است. بنابراين اندازه گيري سطح فعاليت آن در عوارض سوختگي و التهاب هاي ناشي از راديکال هاي آزاد به منظور اهداف درماني مي تواند مفيد باشد.
فعاليت PON1 در بين افراد مختلف متفاوت مي باشد و فاکتور هاي متعددي در اين امر دخيل است. پلي مورفيسم ژنتيکي در ژنوم PON1 يک فاکتورتاثير گذار در مقداري از اين تغييرات ميباشد. از پلي مورفيسم ژن پاراکسوناز در موقعيت هاي M/L 55 وQ/R 192 چندين ايزوزيم ايجاد مي شود که فعاليت شان نسبت به سوبستراهاي گوناگون متفاوت مي باشد.
در اين مطالعه فعاليت سرمي آنزيم PON1 در 57 بيمار مواجهه يافته با سوختگي و 57 نفر از افرادسالم با سن وجنس و بدون هيچ بيماري زمينه ايي مورد مطالعه قرار گرفت.
با توجه به عوارض التهاب در بيماران دچار سوختگي و عدم تعادل اکسيدان / آنتي اکسيدان در بيماران دچار سوختگي بر آن شديم در اين مطالعه فعاليت آنزيم PON1 را در بيماران دچار سوختگي بستري شده در بيمارستان سوانح و سوختگي مطهري تهران را بررسي کنيم .
با وجود ناشناخته بودن مکانيسم عوارض ديررس ناشي از سوختگي در ايجاد ضايعات سوختگي، اين مطالعه به منظور تعيين ارتباط آنزيم PON1 به عنوان يک عامل مهم آنتي اکسيداني با شدت بيماري و عملکرد بافت در ضايعات سوختگي انجام شد. هدف اصلي اين مطالعه تعيين ارزشمندي فعاليت PON1 به عنوان يک بيومارکر براي تشخيص حساسيت افراد به بروز عوارض سوختگي، شدت بيماري و عملکرد بافت در ضايعات سوختگي ناشي از التهاب ميباشد.
مقدمه:
انواع راديکال آزاد:
به طور کلي راديکال هاي آزاد در دو دسته قرار مي گيرند:
راديکال آزاد اکسيژن دار (که زير مجموعه اي از ROS ها هستند ) و راديکال آزاد فلزي
راديکال آزاد اکسيژن دار
راديکال آزاد را به صورت (R°) نشان مي دهند واژه گونه فعال اکسيژن (ROS) اغلب به راديکال آزاد و ديگر ترکيبات اکسيژن فعال از جمله اکسيژن يکتا (O°) ، پراکسيد هيدروژن (H2O2) نيز اطلاق مي شود که قادرند که الکترون را از سوبسترا هاي مختلف به سادگي دريافت کنند و آنها را به راديکال آزاد تبديل نمايند . تمام اين ترکيبات قدرت انجام واکنش هاي راديکالي را دارند(1). مهمترين راديکال هاي آزاد در سيستم هاي زنده، آنيون سوپراکسيد (O2) ، راديکال هيدروکسيل(OH°)، نيتريک اکسيد (NO)، مشتقات راديکالي پراکسيل ليپيد(ROO°) و راديکال هاي الکوکسيل (RO) هستند. هنگامي که يک راديکال با يک مولکول غير راديکالي اندرکنش مي دهد، مولکول هدف به يک راديکال تبديل مي شود که خود ميتواند اين سري از واکنش ها را به صورت آبشاري ادامه دهد . ROSها در حقيقت با اکسيد کردن مولکول هاي ديگر و تبديل آن ها به ROS هاي جديد، باعث احيا و پايدار شدن خود مي شوند. به اين اکسيد کننده هاي فعال، اکسيدان گويند. راديکال هاي آزاد با بعضي از قسمت هاي سلول مثل DNA و غشاي سلولي واکنش نشان داده و باعث تخريب عمل سلول يا حتي مرگ آنها مي شوند. بيشترين اثر تخريبي راديکال هاي آزاد متوجه غشا سلولي ارگانل ها داخل سلولي نظير غشا ميتوکندي ها است.
راديکال هاي آزاد فلزي
بشتر بررسي هاي متمرکز بر سيمت و کارسينوژن بودن فلزات، بر نقش آنها در توليد گونه هاي فعال اکسيژن و نيتروژن در سيستم هاي بيولوژيکي تاکيد دارد. مطالعات نشان مي دهد که فلزاتي ازقبيل آهن، مس، کروم، سرب، جيوه، نيکل و واناديوم ROS توليد مي کنند(2). فلزات دو ظرفيتي همانند آهن و مس موجود در زنجيره انتقال الکترون وآنزيم هاي مصرف کننده اکسيژن (به عنوان يک جز اصلي آنزيم يا کوآنزيم ) نقش اساسي در واکنش هاي اکسيداسيون و اتواکسيداسيون بازي مي کند. براي مثال واکنش هاي اپي نفرين و ويتامين C با اکسيژن بدون يون اهن يا مس بسيار کند صورت ميگيرد، بنابراين وجود اهن ومس به صورت آزاد در بدن انسان به دليل تسريع در واکنش هاي اتواکسيداسيون مضر بوده و در واکنش با H2O2، راديکال خطرناک OH را به وجود مي آورند. پراکسيد هيدروژن ميتواند به راديکال هيدروکسيل که بشدت آسيب رسان است تبديل شود و يا مي تواند متابوليزه شود و به صورت آب بدون ضرر دفع شود
بعضي از آنزيم ها از جمله گلوتاتيون پراکسيداز، پراکسيد هيدروژن را به آب تبديل ميکنند. تبديل H2O2 به آب ايجاد اکسيژن يگانه ميکند که راديکال آزاد نيست اما ايجاد ان طي واکنش هاي راديکالي مي تواند باعث واکنش بيشتر (بعنوان کاتاليزور) شود.
مکانيسم عمل راديکال هاي آزاد
راديکال آزاد به هر فرم (آنيوني، کاتيوني و خنثي) مي تواند وجود داشته باشد و در هر صورت داراي حداقل يک تک الکترون آزاد مي باشد که آن را (مولکول يا اتم راديکالي ) از نظر انرژي و ترموديناميک ناپايدار مي کند و با حمله به مولکول هاي ديگر و گرفتن تک الکترون و يا از دست دادن الکترون خود مي تواند به پايداري برسد و باعث ناپايدار شدن مولکول مورد تعرض و در حقيقت تبديل آن مولکول به راديکال آزاد شود. بنابراين يک واکنش زنجيره اي موجب افزايش راديکال هاي آزاد مي شود. توليد، افزايش و خاتمه راديکال آزاد در سه مرحله انجام مي شود(3).
مرحله شروع(initiation)
مرحله تکثير(propagation)
مرحله پاياني(termination)
عملکرد و آسيب رساني راديکال هاي آزاد در بدن به دو صورت مي باشد:
عملکرد مستقيم راديکال هاي آزاد باعث تخريب پروتئين ، چربي و اسيد نوکلئيک مي شوند .
عملکرد غير مستقيم راديکال هاي آزاد باعث برهم زدن تعادل سيستم آنزيم هاي انتي اکسيداني مي شوند(3).
عوامل اکسيداني در بدن موجود زنده
گونه هاي فعال اکسيژن يا عوامل اکسيداني در بدن موجودات زنده دو منشا دارند، يا توليد آنها از طريق متابوليسم طبيعي بدن است و يا بر اثر عوامل خارجي ايجاد مي شوند. به علاوه گونه هاي فعال اکسيژن در بدن موجودات زنده با حمله به ماکرومولکول هاي حياتي بدن باعث توليد مشتقات راديکالي اين مولکول ها مي شود که اين مولکول هاي به نوبه خود به عنوان ROS عمل کرده و واکنش هاي آبشاري اکسيداتيو را انجام مي دهند و به تدريج باعث تخريب بافتي مي شوند.
عوامل اکسيداني با منشا دروني
توليد راديکال هاي آزاد در طي متابوليسم طبيعي بدن و اعمال فيزيولوژيک ضروري با عنوان توليد عادي راديکال ها در نظام بيولوژيک نيز مطرح مي شوند و مهمترين منابع توليد ان در بدن به شرح زير است.
زنجيره تنفسي ميتوکندري
زنجيره انتقال ميتوکندي يکي از منابع داخلي عمده توليد راديکال آزاد است. در سلول هاي هوازي احياي ناقص اکسيژن در زنجيره انتقال الکترون ميتوکندري، راديکال هاي آنيوني سوپراکسيد را به داخل سيتوزل آزاد ميکند راديکال هاي سوپراکسيد نسبتا غير فعال اند اما مي توانند به واسطه يون هاي فلزي مانند آهن و مس در توليد مواد فعال تري از قبيل پراکسيد هيدروژن و راديکال هيدروکسيل شرکت کنند.
بررسي ها نشان داد که ميتوکندري مقدار معني داري پراکسيد هيدروژن توليد مي کند. تخمين مي زنند که توليد پراکسيد هيدروژن تحت شرايط فيزيولوژيک حدود 2% جذب تام اکسيژن توسط موجود را در بر ميگيرد. به هرحال شناسايي وجود راديکال سوپراکسيد در ميتوکندري سالم به دليل فعاليت بالاي آنزيم سوپراکسيد دسموتاز (SOD) مشکل است. همچنين يوبي سمي کوئينون به عنوان خنثي کننده اصلي اکسيژن در غشا هاي ميتوکندري ذکر مي شود(4).
راديکال هاي سوپراکسيد تشکيل شده در هر دوقسمت غشا داخلي ميتوکندري به طورکامل در ابتدا به پراکسيد هيدروژن و سپس توسط CU_SOD، ZN ( درواقع در فضاي بين غشايي SOD ) و (Mn-SOD) (SOD، واقع در ماتريکس) سمي زدايي مي شوند. اما سوپراکسيد بواسطه نيمه عمر طولاني اش (50/0 ثانيه در غياب رويشگر ها) موجب غير فعال شدن آنزيم هايي از قبيل کاتالاز و گلوتاتيون پراکسيداز و اکسيداسيون اجزاي درون سلولي از قبيل گلوتاتيون مي شوند.
عمل سيتوکروم P450
سيتوکروم P450 که در غشا شبکه آندوپلاسمي سلول هاي کبدي وجود دارد با هيدروکسيله نمودن سموم گرچه باعث افزايش حلاليت و دفع سريعتر آنها مي شود ولي در حين اين عمل سبب ايجاد محصولات فرعي اکسيداتيو مي شود(5). پيشنهاد شده است که سيتوکروم P450 نيز منبع توليد گونه هاي فعال اکسيژن است. گونه هاي فعال اکسيژن به ويژه آنيون سوپراکسيد و پراکسيد هيدروژن احتمالا از طريق القا سايتوکروم آنزيم P450 (به دنبال شکست يا uncoupling چرخه کاتاليتيکي P450) توليد مي شوند.
متابوليسم ايکوزانوئيدها (اسيد چرب 10 کربنه)
پروستاگلاندين و لوکوترين ها از متابوليسم اسيد آراشيدونيک حاصل مي شوند که طي دو مسير توليد و مصرف راديکال هاي آزاد مشتق شده از O2 ساخته مي شوند. همچنين راديکال هاي آزاد اکسيژن در اثر فعاليت آنزيم سيکلواکسيژناز، آزاد و با فيدبک منفي، منجر به غير فعال شدن سيکلواکسيژناز و مهار سنتز پروستاگلاندين ها مي شوند.
فرايند فاگوسيتوز
فرايند فاگوسيتوز در عملکرد ايمني بسيار مهم وحياتي مي باشد. در مرحله انفجار تنفسي در نوتروفيل ها و ماکروفاژها، آنزيم NADPH اکسيداز موجود در غشا پلاسمايي اين سلول ها موجب احيا شدن اکسيژن و تبديل آن به راديکال سوپراکسيد شده، سپس طي يک سري از واکنش هايي که با يون هاي فلزي کاتاليز مي شود ساير راديکال هاي آزاد حاوي اکسيژن را توليد ميکند. لوکوسيت ها همچنين حاوي آنزيم هاي ديگري مثل ميلوپراکسيداز هستند که باعث ايجاد HOCL از H2O2 مي شوند .در نتيجه تخريب آنتي ژن هاي بلعيده شده توسط اين سلول ها انجام مي شود.
در ماکروفاژ فعال شده ما شاهد افزايش جذب اکسيژن هستيم که بسياري از گونه هاي فعال اکسيژن از قبيل آنيون سوپراکسيد، نيتريک اکسيد و پراکسيد هيدروژن را توليد مي نمايد.
راديکال نيتريک اکسيد
نيتريک اکسيد در فرايند هاي فيزيولوژيکي زيادي از قبيل گشاد کنندگي عروق، انتقال پيام و غيره شرکت دارد. همچنين نقش دفاعي ضد باکتريايي در بدن از خود نشان مي دهد. اما NO مي تواند با دآمينه کردن بازهاي DNA و يا تبديل سيتوزين به اوراسيل و متيل سيتوزين به تيمين ايجاد جهش و درنتيجه تومور کند.
واکنش هاي پراکسي زومي
ميکروزوم ها و پراکسي زوم ها نيز منابع توليد ROS مي باشند. ميکروزوم ها مسئول توليد 80 درصدي H2O2 در جايگاه هاي هيپراکسي در in vivo هستند(6) .مشخص شده است که تحت شرايط فيزيولوژيک پراکسي زوم هاي H2O2 توليد ميکنند نه O2. اگرچه کبد اندام اصلي بوده و نقش پراکسي زوم آن در توليد H2O2 تام معني دار است اما پراکسي زوم اندام هاي ديگر نيز داراي مکانيسم توليد H2O2 طي گرسنگي طولاني مدت است بيشتر واکنش هاي متابوليکي که محصول فرعي آنها H2O2 مي باشد در اندامک درون سلولي پراکسي زوم انجام مي گيرند و در اين اندامک، آنزيم کاتالاز بيشتر پراکسيد هيدروژن توليد شده را به محصولات بي ضرر آب و اکسيژن مولکولي تجزيه ميکند.
عوامل اکسيداني با منشا خارجي
سيگار
دود سيگار حاوي 300 تا 500 PPM راديکال نيتريک اکسيد (NO) مي باشد. اکسيد هاي نيتروژن (NOx) موجود در دود سيگار باعث اکسايش ماکرومولکول هاي حياتي و کاهش سطح آنتي اکسيدان هاي بدن مي شود.
فلزات دو ظرفيتي
فلزات دو ظرفيتي نظير آهن و مس توليد راديکال OH را از H2O2 افزايش مي دهند . در بيماري هموکروماتوز که يک نقص ژنتيکي مردان است، روزانه مقادير زيادي آهن جذب بدن مي شود در نتيجه بيماري حاصل از اکسيدان ها در اين افراد بيشتر مشاهده مي شود(7).
اشعه هاي يونيزان
اشعه هاي يونيزان عامل خارجي مهمي در توليد راديکال هاي آزاد مخصوصا گونه هاي فعال اکسيژن مي باشند. معمولي ترين اشعه، اشعه UV مي باشد که بر اثر تخريب لايه اوزون (O3) داراي اثرات سرطان زائي مخصوصا سرطان پوست است(8).
آلاينده هاي هوا
بسياري از آلاينده هاي شيميايي هوا ناشي از سوخت هاي سرب دار است که توسط وسايط نقليه توليد مي شوند، و همچنين مواد افزايش دهنده O3 اتمسفر نيز به عنوان اکسيدان محسوب مي شوند.
داروها و سموم
اثرات سمي داروها در طي متابوليسم آنها در بدن و با ايجاد راديکال هاي آزاد صورت مي گيرد مثلا سيکلوسپورين باعث افزايش توليد گونه هاي فعال اکسيژن مي شود. استامينوفن نيز باعث ايجاد سميت در سلول هاي کبدي مي شود که اين عمل مربوط به ايجاد راديکال هاي آزاد است(9) .درحاليکه منشا اين عوامل مشخص شد به نقش آنها در ايجاد اختلالات احتمالي مي پردازيم.
اثر راديکال هاي آزاد بر ماکرومولکول ها
اثر راديکال هاي آزاد بر پروتئين ها:
گونه هاي مختلف اکسيژن (راديکال هاي اکسيژن) مي توانند به طور مستقيم با پروتئين ها در جايگاه هاي خاص واکنش دهد، و راديکال هاي پروتئين ايجاد شده نيز به نوبه خود مي توانند به طور سريع در ساختمان پروتئين جابجا شوند زنجيره هاي جانبي اسيد هاي آمينه به خصوص خيلي تحت تاثير اين راديکال ها (بيشتر آلکوکسيل و پروکسيل ) مي باشند.
اکسيد شدن پروتئين ها بر اثر حمله راديکال هاي آزاد حساسيت آنها به پروتئوليز و همچنين آب گريزي آنها را افزايش مي دهد. راه هاي مختلف حمله پروتئين ها به نوع اکسيدان و راديکال آزاد توليد شده بستگي دارد. راديکال آزاد ممکن است با اسيد هاي آمينه داراي گروه غير اشباع يا سولفوري مانند تيروزين، فنيل آلانين، تريپتوفان، هسيتيدين، سيستئين، متيونين واکنش داده و باعث برهم زدن ساختمان پروتئين و يا ايجاد پيوند عرضي شود مراحل مختلف پروتئين سازي نيز مي تواند توسط راديکال هاي آسيب ديده و سنتز پروتئين متوقف شود در نتيجه در بسياري از پديده ها که حضور پروتئين ضروري است اختلال ايجاد مي شود(10).
اثر راديکال هاي آزاد بر ليپيد ها
ايجاد راديکال آزاد در سلول بوسيله پراکسيداسيون ليپيد با جدا شدن اتم هيدروژن از کربن ميتلن زنجيره اسيد چرب شروع شود و هرچه اسيد چرب غير اشباع تر باشد يعني تعداد بيشتري از پيوند دوگانه داشته باشد قابليت پراکسيد شدن بيشتري دارد. انتقال واکنش پراکسيداسيون بين زنجيره هاي اسيد چرب مجاور باعث گسترده شدن پراکسيداسيون ليپيد و تبديل اسيد چرب به ليپيد هيدرو پراکسايد شده که منجر به صدمات بافتي و نهايتا بيماري هاي مختلف مي شود.
راديکال هاي هيدروپراکسيل و هيدرواکسيل به زنجيره هاي غير اشباع يا داراي پيوند دوگانه C=C حمله کرده و باعث اکسيدشدن فسفوليپيد ها و ساير چربي هاي غشايي شده و همچنين با کاهش نسبت کلسترول به فسفوليپيد ها باعث کاهش سياليت غشا ودر حقيقت کاهش ثبات غشاهاي سلولي مي شوند و به دليل اينکه غشا نقش بسيار مهمي در محافظت و تبادل سلولي دارد، مسئله پراکسيداسيون ليپيد ها بسيار با اهميت مي باشد. بسياري از بيماري هاي حاصل از راديکال هاي آزاد، مربوط به اثر آنها بر ليپيد هاي غشا مي باشد که شامل بيماري التهابي، سرطان، تصلب شراين و تخريب بافت عصبي و نورون ها به دليل تخريب ميلين ها است .
پراکسيداسيون ليپيد ها در بافت هاي جانوري در ايجاد بيماري و افزايش سميت آنها نقش دارد. بافت هاي تخريب شده (بخصوص تخريب مکانيکي) سريعتر از بافت هاي سالم دچار پراکسيداسيون مي شوند. دليل افزايش پراکسايش شامل آزاد شدن يون هاي فلزي و بخصوص آهن، از جايگا هاي ذخيره ايي داخل سلول و همچنين هيدورليز پروتئين هاي فلز دار (METALO PROTEIN) بوسيله آنزيم هاي پروتئوليتيک آزاد شده از ليزوزوم هاي آسيب ديده است. در انسان، بيماري ها يا سموم مي تواند سبب ايجاد آسيب يا مرگ سلولي شوند که نتيجه آن افزايش پراکسايش ليپيدي است. اين آسيب همانگونه که قبلا گفته شد در سيستم عصبي مرکزي (CNS) بيشتر ايجاد مي شود. بيشترين مقدار آهن CNS در فريتين وجود دارد و هنگاميکه سلول هاي مغزي آسيب مي بيند مقدار زيادي از آهن آنها به راحتي آزاد مي شود.
در اثر پراکسيداسيون ليپيدي غير اشباع غشا سلول ها رنگدانه هايي به نام ليپوفوسين يا سروئيد تشکيل مي شود و تجمع اينها در سيتوپلاسم سلول هاي عصبي افراد مسن مشاهده شده است. اين رنگدانه ها اگر با طول موج تحريکي 365 نانومتر تحريک شوند در طول موج 470 داراي نشر خواهند بود(11).
استرس هاي فيزيولوژيک مثل سرما و کمبود آنتي اکسيدان هايي مانند ويتامين E نيز مي تواند سبب ايجاد رنگدانه هاي ليپوفوسين شود ليپوفوسين علاوه بر ماهيچه و دستگاه عصبي در سيستم هاي فيزيولوژيک ديگر به طور گسترده مشاهده شده مثلا در بافت هاي پيوندي پير باعث تغييرات شديدي چون کاهش سلول ها و توقف تقسيم سلولي مي شود و مي توان تصور کرد که عامل اصلي بيماري هاي ايجاد شده با پراکسيداسيون ليپيدها ايجاد اين رنگدانه است.
افزايش محصولات پراکسيداسيون ليپيدي هم در بافت و هم در پلاسما شاخصي براي پراکسيداسيون ليپيدي است. محصوات اوليه شامل ليپيد هيدرو پراکسايد است که با روش HPLC اندازه گيري مي شود ومحصولات ثانويه شامل مالون دي آلدهيد، 4HNE و هيدروکربن فعال مي باشد. مالون دي آلدهيد بيشترين محصول ثانويه توليدي است که مي تواند با گروه هاي آمين پروتئين واکنش دهد. با تست TBA(تيوباربيتيک اسيد ) ميزان MDA را در بافت و سرم مي توان اندازه گيري کرد که رابطه مستقيم با ميزان صدمات پراکسيداسيون دارد(12).4HNE ديگر محصول آلدهيدي اصلي حاصل از پراکسيداسيون ليپيد علاوه بر مالون دي آلدهيد مي باش . 4HNE اثرات قوي بر مسير انتقال پيام داشته که به نوبه خود اثر اصلي روي صفات فنوتيپي سلول مي گذارد. 4HNE يک ترکيب دوگانه است اما ويژگي ليپوفيلي بيشتري دارد. لذا اين ترکيب تمايل دارد تا در غشا هاي زيستي انباشته شود يعني جايي که فسفوليپيد هايي از قبيل فسفوتيديل اتانول آمين و پروتئين هايي نظير ناقل، کانال هاي يوني و گيرنده ها وجود دارند و به سرعت با 4HNE واکنش مي دهند(13).
اثر راديکال هاي آزاد بر اسيد نوکلئيک
گونه فعال اکسيژن (ROS) با حمله به اسيد دزوکسي ريبونوکلئيک (DNA) باعث ايجاد اتصالات عرضي بين دو رشته و آسيب به DNA مي شود. بطور کلي شکستگي در يک يا دو رشته DNA باعث جهش، آپوپتوز يا مرگ سلولي برنامه ريزي شده، تومور زايي و 000 مي شود
در مجموع عوارض اکسيدان و راديکال هاي آزاد به صورت بيماري هاي خطرناکي همانند سرطان، نارسايي قلبي و عروقي، بيماري هاي مغزي، تحليل و تضعيف سيستم ايمني و پيري مي شود(14).
با توجه به مطالب فوق بدن موجود زنده به علت عوامل مختلف اکسيداني در مخاطرات وجود دارد که به شرح آنها مي پردازيم.
مکانيسم دفاع آنتي اکسيداني
تاثيرات مضر گونه هاي فعال اکسيژن و نيتروژن به واسطه عملکرد آنتي اکسيداني، آنتي اکسيدان هاي غير آنزيمي شامل ويتامين C، ويتامين E، کاروتنوئيد ها، آنتي اکسيدان هاي تيولي (گلوتاتيون، تيرودوکسين، اسيد ليپوئيک)، فلاونوئيد هاي طبيعي، محصولات هورموني غده پينه آل، ملاتونين وترکيبات ديگر مي باشند(15). بعضي آنتي اکسيدان ها در محيط هيدروفوليک عمل ميکنند و برخي ديگر در محيط هاي هيدروفوبيک و تعدادي در هر دو محيط سلول مي کند. براي مثال ويتامين C در فازآبي با سوپراکسيد برهمکنش مي کند در حالي که ويتامين E در فاز ليپوفيليک به اين شکل عمل ميکند. برخي از آنتي اکسيدان ها قادر به توليد مجدد آنتي اکسيدان هاي ديگر بوده و بنابراين عملکرد اوليه آنها را تجديد ميکنند، اين فرايند را شبکه آنتي اکسيداني مي نامند(15). با توجه به اينکه موضوع مورد مطالعه در اين پژوهش بيشتر معطوف به نقش آنتي اکسيداني آنزيم پاراکسوناز مي باشد به بررسي اين آنزيم مي پردازيم.
بررسي متون:
پاراکسوناز PON1
پاراکسوناز يکي زا اعضا خانواده سه عضوي PON1، PON2، PON3مي باشد. ژن هاي کد کننده اين آنزيم ها مجاور يکديگر روي بازوي بلند کروموزوم 7 قرار دارند(16). پاراکسوناز سرم انساني(PON1) يک پروتئين گليکوزيله از 354 آمينو اسيد با وزن مولکولي 43 کيلو دالتون است. بيشتر از 80% تشابه آمينو اسيدي در پروتئين PON1 خرگوش، موش و انسان و حداقل 60% تشابه بين PON1 ، PON2،PON3 در هرکدام از اين گونه ها وجود دارد(16).
PON1 ابتدا در پستاندارن شناسايي شد ولي اکنون در مرغ ، ماهي و حتي در بي مهرگان نيز ديده شده است، گرچه فعاليت آن در حشرات ، پرندگان و ماهي ها ناچيز است(17). ژن PON1 در انسان و موش شامل 9 اگزوژن با تقريبا 25 تا 26 کيلو باز مي باشد(18). بيش از 200 پلي مورفيسم تک نوکلوئوتيدي به تنهاي در ژن PON1 انساني شناسايي شده است(17). وجود گونه هاي پلي مورفيک درPON 1 ها نشانگر ارائه نقش هاي فيزيولوژيک متفاوت توسط آنها است.PON1 ،PON3 در کبد بيان و در خون، جائي که به ذرات HDL متصل مي شوند، ترشح مي گردند(19)و(20). مقدار PON1 در خون انسان mg/L 50 مي باشد(18).PON2 در خون موجود نيست ولي در بعضي از بافت ها از جمله کبد، ريه ها، مغز وقلب بيان مي شود(17). خانواده پاراکسوناز يک خانواده هيدرولاز با يکي از وسيعترين ويژگي هاي شناخته شده مي باشد.PON1 نسبت به چندين سوبستراي سنتزي به عنوان يک استراز قوي عمل مي کند. در حالي کهPON2 و PON3 تقريبا فعاليت پاراکسونازي نداشته ولي فعاليت لاکتونازي از خود نشان مي دهند(17). برايPON ها انواع نقش هاي فيزيولوژيکي از جمله عمل فسفوليپاز A2 در هيدروليز فاکتور هاي فعال کننده پلاکت PAF)) (13) و ليپيد هاي اکسيد شده، هيدروليز و غير فعال سازي هموسيستئين تيولاکتون، ريسک فاکتور بيماري آترواسکلروز عروقي(21)، پيشنهاد گرديده است از آنجا که ترکيبات هيدروليز شده توسط پاراکسوناز مانند ارگانوفسفات ها، گاز هاي عصبي و استر هاي آروماتيک سوبستراهاي غير فيزيولوژيک هستند، لذا احتمالا اين فعاليت ها عملکرد فيزيولوژيکي آنزيم نمي باشند. در تحقيقات اخير از فعاليت لاکتونازي آنزيم به عنوان فعاليت طبيعي PON 1 نام برده شده است(22) از مطالعات ساختار – فعاليت چنين برمي آيد که لاکتون ها سوبستراي ارجح براي PON1 مي باشند.
از فعاليت هاي آنزيماتيک پاراکسوناز انساني (PON1) مي توان به موارد زير اشاره نمود(17):
هيدروليز متابوليت هاي اکسون حشره کش ها مانند پاراکسون
– هيدروليز گاز هاي شيميايي عصبي مانند سارين و سومان
هيدروليز استرهاي آروماتيک مانند فنيل استات
هيدروليز لاکتون ها و لاکتونيزاسيون هيدروکسي اسيد ها مانند هيدروکسي کربوکسيليک اسيد ها
نقش پاراکسوناز (PON1) در انسان
تاکنون نقش آنزيمي پاراکسوناز به طور in vivoمشخص نشده ولي تصور مي شود که موجب کاهش اکسيداسيون LDL مي گردد. اين فرضيه براساس يافته هاي in vitro شکل گرفت که نشانگر مهار تجمع پراکسيد هاي ليپيدي در LDL توسط آنزيم بود(19). در ديواره شرياني، ذرات LDL اکسيد شده توسط رسپتور هاي مخصوص ox LDL روي ماکروفاژها شناسايي و به درون سلول کشيده مي شوند. از آنجا که براي اين برداشت هيچ مکانيزم فيدبک منفي وجود ندارد اي پروسه احتمالا به يک انباشتگي (overload) ليپيدي در ماکروفاژ هاي منجر شده که موجب ترکم ليپيدي و تشکيل يک نوار چرب، شاخص آترو اسکلروز، مي گردد. اکسيداسيون LDL يک مرحله کليدي در پاتوفيزيولوژيکي آترواسکلروز و پيدايش بيماري هاي قلبي و عروقي به شمار مي رود، لذا پارکسوناز به جهت نقش داشتن در کاهش اکسيداسيون LDL بسيار مورد توجه محققان ميباشد. جدا از مهار اکسيداسيون LDL، نتايج حاصل از مطالعه روي مدل هاي in vitro و حيواني همچنين دلالت بر توانايي پاراکسوناز در جلوگيري از اکسيداسيون HDL و حفظ سلامتي آن دارد (23)و(24). بعلاوه بسياري از مطالعات ايپدمولوژي آشکار ساخته که آندسته از پلي مورفيسم هاي موجود در ژن PON1 که مسئول تغيير فعاليت و غلظت آنزيم هستند، در تغيير سطح HDL در جمعيت هاي مختلف سهيم مي باشند(25). از انجا که HDL در بسياري از فعاليت هاي حفاظت کنندگي رگ از قبيل برداشت کلسترول اضافي از بافت ها (ترانسپورت معکوس کلسترول ) و مهار پروسه هاي التهابي شرکت دارد(26)و(27)، لذا محافظت از HDL در مقابل آسيب هاي اکسيداتيو احتمالا يکي از نقش هاي مهم پاراکسوناز باشد. مکانيزم فعاليت آنتي اکسيداني پاراکسوناز شامل هيدروليز پراکسيد هاي ليپيدي و هيدروپراکسيد هاي کلسترول استر ها مي شود.
در خون پاراکسوناز همچنين مي تواند سيستئين تيولاکتون، متابوليت هموسيستئين، را هيدروليز کند. هموسيتئين تيولاکتون با تاثير منفي بر سنتز پروتئين موجب اختلال در عملکرد اندوتليال و آسيب رگي مي گردد(21)، لذا سم زدايي هموسيستئين تيولاکتون يکي از اعمال محافظتي پاراکسوناز از قلب و رگ هاي خوني محسوب مي شود. کشف جالب ديگر در ارتباط با پاراکسوناز که اهميت فارماکولوژيک دارد اين است که مهار کننده هاي HMG-CO ردوکتاز (استاتين ها) بر غلظت و بيان ژن PON 1 تاثير دارند(28)
ساختار کلي پارکسوناز (PON1)
پاراکسوناز داراي يک ساختار six-bladed b propeller است که هر صفحه ان شامل چهار رشته مي باشد(16). يک پل دي سولفيدي بين cys 42 و cys 353 وجود دارد(16). اين پيوند کوالانت بين N و C ترمينال در b-propeller ها با بيشتر از 4 صفحه بندرت ديده مي شود، اما در همه اعضاي خانواده PON ها حفظ شده است. دو اتم کلسيم در تونل مرکزي پروانه قرار گرفته اند (Ca1 در نوک و Ca2 در بخش مرکزي تونل ). Ca2 به احتمال قوي يک کلسيم ساختاري است که جدا شدن آن موجب دناتوره شده برگشت ناپذير مي گردد، در حالي که Ca1 شبيه يک کلسيم کاتاليتيک طراحي شده است(33) به نظر مي رسد که با اين کلسيم 5 رزيدوي پروتئين (اکسيژن هاي زنجير جانبي Asn 224، Asn 270، Asn 168،Asn 269 ، Glu53 اينترکشن داشته باشند. دو ليگاند قوي ديگر، يک مولکول آب و يکي از اکسيژن هاي يون فسفات مي باشند(16). دو کلسيم افينيتي هاي متفاوت نشان مي دهد(29). ليگاسيون شديد تر Ca1 و دسترسي بيشتر آن به حلال موجب افينيتي بالاتر Ca2 مي گردد.
پاراکسوناز در کريستال بيشتر به فرم منومريک وجود دارد، در حاليه پاراکسوناز محلول در دترژنت، دايمر و اليگومر هاي بيشتري تشکيل مي دهد(30) پاراکسونازي که در سلول هاي حيواني بيان مي شود گليکوزيله است(6). گليکوزيلاسيون براي فعاليت هاي هيدروليتيک پاراکسوناز ضروري نيست(31)و(32)، اما ممکن است در افزايش فعاليت حلاليت و پايداري، يا در جلوگيري از اتصال غير اختصاصي آن به غشا هاي سلولي (مانند ديگر آنزيم هاي متصل به HDL) مهم مي باشد(33).
چهار جايگاه N -گليکوزيلاسيون قوي روي پاراکسوناز وجود دارد. دو Asn227 و Asn 270 در تونل مرکزي در پروانه و بسيار غيرقابل دسترس به حلال هستند. درحاليکه Asn 253 و Asn324 روي سطح لوپ ها قرار گرفته اند و به



قیمت: تومان


پاسخ دهید